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| 出口肉中丙硫咪唑残留量检验方法 |
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| 时间：2004-02-04 10:17:51.233 肉业行业网 |
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中华人民共和国进出口商品检验行业标准 中华人民共和国进出口商品检验行业标准
出 口 肉 中 丙 硫 咪 唑 残 留
量 SN 0207—93
检 验 方 法
Method for determination of
albendazole
residues in meat for
export
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1
主题内容与适用范围
本标准规定了出口肉中丙硫咪唑残留量检验的抽样、制样和高压液相色谱测定方法。
本标准适用于出口猪肉中丙硫咪唑残留量的检验。
2
抽样和制样
2.1
检验批
以不超过2500件为一检验批。
同一检验批的商品应具有相同特征,如包装、标记、产地、规格和等级等。
2.2
抽样数量
检验批中的件数 最少抽样件数
1～25 1
26～100 5
101～250 10
251～500
15
501～1 000 17
1 001～2 500 20
2.3
抽样方法
按2.2规定的抽样件数随机抽取,逐件开启。每件至少取一袋作为原始样品,原始样
品总量不少于2kg,放入清洁容器内,加封后,标明标记,及时送实验室。
2.4
试样制备
从每袋原始样品中取出部分有代表性样品,将可食部分放入高速组织捣碎机中捣碎
均匀,充分混匀,用四分法缩分出不少于500g
,装入洁净容器内,加封后,标明标记。
2.5
试样保存
将试样于—18℃冷冻保存。
注：在抽样和制样过程中,必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
3
测定方法
3.1 方法提要
2.5g均匀试样于6N
HCl中水解,用碳酸钠调节pH≥8.0,用乙酸乙酯提取。将丙硫咪
唑代谢物和内标反提取到1N
HCl内。于Sep-Pak柱中净化后,浓缩至干,残渣重新溶解于
流动相中,用具荧光检测器的HPLC进行定量。
3.2 试剂和材料
3.2.1
5-(丙硫酰)-1H苯并咪唑-2-胺：标准品。纯度＞99%。
3.2.2 5-(丁硫酰)-1H苯并咪唑-2-胺：内标。纯度＞99%。
3.2.3
浓盐酸：分析纯。
3.2.4 二甲亚砜(DMSO)：经玻璃仪器蒸馏。
3.2.5 乙酸乙酯：经玻璃仪器蒸馏。
3.2.6
甲醇：经玻璃仪器蒸馏。
3.2.7 甲苯：经玻璃仪器蒸馏。
3.2.8 乙腈：经玻璃仪器蒸馏。
3.2.9 二乙醇胺。
3.2.10
无水碳酸钠：粉末状,分析纯。
3.2.11 磷酸二氢钾：分析纯。
3.2.12 无水磷酸氢二钾：分析纯。
3.2.13
水：去离子水。
3.2.14 氮气：纯度≥99.99%。
3.2.15 标准储备溶液
3.2.15.1
称取10.0mg5-(丙硫酰)-1H苯并咪唑-2-胺于100mL容量瓶内,用DMSO溶解并
稀释至刻度(100μg/mL)。
3.2.15.2
称取10.0mg5-(丁硫酰)-1H苯并咪唑-2-胺于100mL容量瓶内,用DMSO溶解并
稀释至刻度(100μg/mL)。
3.2.16
标准工作溶液
3.2.16.1 移取2.0mL储备溶液(3.2.15.1)及8.0mL DMSO
入一15mL具玻塞离心管内,以
涡式混匀器混匀,制得20μg/mL溶液(3.2.16.1)(2.5g试样中加入50μL此溶液,含量相
当于400μg/kg)。
3.2.16.2
移取5.0mL工作溶液(3.2.16.1)及5.0mL DMSO
入一15mL具玻塞离心管内,以
涡式混匀器混匀,制得10μg/mL溶液(3.2.16.2)(2.5g试样中加入50μL此溶液,含量相
当于200μg/kg)。
3.2.16.3
移取5.0mL工作溶液(3.2.16.2)及5.0mL DMSO
入一15mL具玻塞离心管内,以
涡式混匀器混匀,制得5μg/mL溶液(3.2.16.3)(2.5g试样中加入50μL此溶液,含量相当
于100μg/kg)。
3.2.16.4
移取1.0mL储备溶液(3.2.15.2)及9.0mL DMSO
入一15mL具玻塞离心管内,以
涡式混匀器混匀,制得10μg/mL溶液(3.2.16.4)(2.5g试样中加入50μL此溶液,含量相
当于200μg/kg)。
所有标准溶液均应保存于冰箱内,标准在DMSO溶液中至少可以稳定6个月。因为在
此条件下DMSO会发生凝结,所以使用前需要将离心管放于装有温水的烧杯内,使标准溶
液重新液化,以涡式混匀器混匀。
3.3
仪器和设备
3.3.1 液相色谱仪并配备荧光检测器。
3.3.2 微量注射器：10μL,50μL。
3.3.3 保护柱：CO:PELL
ODS,2mm(内径)×5cm。
3.3.4 微孔过滤器：0.2μm,0.45μm滤膜。
3.3.5
玻璃刻度离心管：具磨口塞,15ml。
3.3.6 离心机。
3.3.7 岛碎机。
3.3.8 吸移管。
3.3.9
pH计。
3.3.10 涡式混匀器。
3.3.11 真空抽滤器。
3.4 测定步骤
3.4.1 提取和净化
3.4.1.1
取试样代表性部位,以捣碎机进行充分匀化。匀化后的试样在分析前一直冷冻
保存。
3.4.1.2
将一去皮重的烧杯置于天平上,烧杯中放一50mL玻璃离心管(未加塞),用粗管
尖吸移管取样,称取2.5±0.05g均匀试样,置于离心管底部。如此分别制备四份空白组织
试样,及一份对照试样,三份添加标准的试样。在对照试样中加入100μL纯DMSO。在疑有
丙硫咪唑残留物的组织试样中加入50μL
DMSO。在空白组织试样和疑有丙硫咪唑的组织
试样中分别加入50μL工作溶液(3.2.16.4)。然后,在已加入50μL工作溶液(3.2.16.4)
的三个空白组织试样中分别加入50μL工作溶液(3.2.16.1)、(3.2.16.2)、(3.2.16.3)。
注：应将添加溶液加于50mL管内刚好浸没均匀试样,以便下一步加入HCl时确保有足
够的溶液。
3.4.1.3.
在3.4.1.2制备的每一试样中加入2.5ml 6N
HCl,盖好每支管,然后将试样管
(用另一试管架固定,以防塞子突然跳出)放到预先调至110±4℃的烘箱内。
3.4.1.4
在1h后,把试样从110±4℃的烘箱中取出,将试样管放于干冰或冰上约5min,冷
却至室温。
3.4.1.5
向每个试样中加入2.0mL水,然后以涡式混匀器混匀试样,用pH计监测pH值。
慢慢加入足量(约1.23g)的碳酸钠,加入时间约需4～5min,以免起泡或结块,调节pH至8～
9.5(将洁净的pH电极直接放入试样中测定。记录pH值后,在离心管内壁上轻轻接触去掉
电极上的液滴。将整个电极从试样管中取出,用水冲洗,擦干后再测定下一个试样。)
注：室温或接近室温的试样,加入碳酸钠时象较冷试样那样不会产生泡沫,因此,加
入碳酸钠时可以快些。
3.4.1.6
向每个试样内加入15mL乙酸乙酯,盖上塞子,平放于试管架上,振摇5min。然
后取下塞子,于约4000r/min将试样离心5min。
3.4.1.7
用吸移管将乙酸乙酯提取液转入另一50mL玻璃离心管内,应尽量转移完全。
注意不要带走水相。
3.4.1.8
重复操作3.4.1.6和3.4.1.7步骤,再次提取每个试样,把相应的提取液合并于
各自的50mL玻璃离心管内。
3.4.1.9
向每个合并的乙酸乙酯提取液中加入4.0mL 1 N HCl,盖上塞子,平放于试管
架上,振摇5min。取下塞子,然后于4
000r/min左右离心5min。
3.4.1.10
尽量完全吸去乙酸乙酯相,注意不要带走水相。在35±5℃水浴上蒸去水溶
液上残留的乙酸乙酯(＜1mL)。(必要时,可在此步骤停止分析操作,而放置过夜。)
3.4.1.11
以涡式混匀器将每一试样混匀,同时慢慢加入足量(约0.33g)碳酸钠,加入时
间约需1～2min,以免起泡或结块。用pH计监测pH值,每个试样的pH值应为8～9.5。
3.4.1.12
向每个试样中加入20mL甲苯,盖上塞子,平放于试管架上,振摇5min,取下塞
子,于4 000r/min左右将试样离心5min。
3.4.1.13
尽量完全吸去甲苯相,注意不要带走水相。在35±5℃的水浴上蒸去水相上残
留的甲苯(＜1mL)。(必要时可在此步骤停止分析操作,而放置过夜。)
3.4.1.14
对于每一个试样,相对应将一10mL玻璃注射器(圆柱形推液塞要取下)用夹子
固定在环形架上。注射器的路氏接头前端连接SEP-PAK
C18柱体。
3.4.1.15
将每支柱用2mL甲醇预洗,而后用2mL0.2M磷酸钾缓冲溶液(pH8.0)洗涤。
加入每种试剂后,经过安装于注射器顶部的橡皮塞缓缓通入氮气,利用氮气压力使试
剂穿过柱体。当氮气开始出柱时即停气。氮气流速约1～2ml/min。弃去洗脱液。
3.4.1.16
从步骤3.4.1.13中得到的每一试样水相转入预先洗涤好的各注射器柱系
统内。用步骤3.4.1.14的方法,应用氮气使溶液流经柱体洗提,然后各取每一试样管
水洗液1mL(经涡式混匀器混匀),使用巴氏吸移管采用类似方法将水洗液分别转入各
注射器柱系统内,弃去洗脱液。
3.4.1.17
再取每个试样管水洗液1mL(经涡式混匀器混匀),分别转入各注射器柱系
统内,按步骤3.4.1.15的方法应用氮气使此水洗液流经柱体洗提,弃去洗脱液。
3.4.1.18
向每一注射器柱系统内分别加入2mL甲苯,按步骤3.4.1.15的方法用氮气使
甲苯流经柱体洗提,弃去洗脱液。
3.4.1.19
在每一注射器柱系统下面分别放置一15mL离心管,向每个柱系统内加入2mL
乙酸乙酯,按步骤3.4.1.15的方法用氮气使乙酸乙酯流经柱体进行洗脱。在这部分洗脱
液中含有待测化合物。
3.4.1.20
向步骤3.4.1.19中得到的每份洗脱液中分别加入约0.5mL甲醇,以涡式混匀器
混匀,以得到均匀的溶液。
3.4.1.21
于35±5℃的水浴上在干燥氮气下将步骤３.4.1.20得到的洗脱液浓缩至干。
3.4.1.22
至干后,加入0.5mL水－甲醇溶液(70＋30),以涡式混匀器混匀,重新
溶解残渣。
3.4.1.23
30min后,将每个重新溶解的试样加入微量过滤装置内,采用0.2μm再生
纤维素滤膜过滤。然后将每个过滤器及试样提取液于4
000r/min左右离心5～10min。
3.4.1.24
将滤液转入15mL具塞玻璃离心管内,用水－甲醇(70＋30)调节每一滤液
体积为0.5mL。使用硅烷化管有助于将提取液浓缩于管的底部。以涡式混匀器混匀后
移取0.1mL供HPLC分析。
3.4.2
测定
3.4.2.1 液相色谱条件
a.色谱柱：μBondapak C18柱,30cm×3.9mm内径；
b.流动相：68%0.02M
KH2PO4 : 0.01M二乙醇胺(200mL0.1 M
KH2PO4＋1.05g二乙
醇胺,加水至1L)；
20%甲醇；
12%乙腈。
该溶液当日新配,使用前用0.45μm滤膜,并用真空系统抽气。
c.流速：18mL/min；
d.温度：室温。
3.4.2.2
色谱测定
先将激发波长和发射波长分别调节在300nm和320nm,狭缝宽度≤10nm。设置合理的
基线灵敏度,注入适量试样(20μL),然后观察标准和内标响应峰的强度。若需更好的灵
敏度,则进行如下步骤：
在观察检测器吸收响应时,在5nm以内调节激发波长,以减小本底零值。如上再次进
样,确定欲测化合物的信号响应是否增加。按此程序继续选择最佳激发波长和发射波长,
直至得到合适的分析信噪比(s/n≥25/1)。
在上述条件下,其保留时间：丙硫咪唑代谢物约4.3min,内标约7.0min。
3.4.3
结果计算
若没有积分仪,则可以用峰高值和峰高比来代替下面所讨论的峰面积和峰面积比。
对于每个试样提取液,HPLC测定所得丙硫咪唑代谢物的峰面积除以内标的峰面积,得
到峰面积比。
丙硫咪唑代谢物峰面积
峰面积比=───────────
内标峰面积
在直角坐标上,以峰面积比为纵坐标,以对照试样加入标准的μg/kg值为横坐标作
工作曲线。根据曲线得回归方程。由回归方程从未知试样的峰面积比按下式直接计算
丙硫咪唑代谢物的μg/kg值：
Y-b
X=────-
m
式中：X——待测试样中丙硫咪唑代谢物的浓度,μg/kg；
Y——待测试样提取液的峰面积比；
b——回归方程的截距；
m——回归方程的斜率。
4
方法的测定低限和回收率
4.1 测定低限：25μg/kg。
4.2
回收率
回收率的实验数据：丙硫咪代谢物浓度范围0.05～0.20mg/kg时,回收率为86.9%
～93.25%。
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附加说明：
本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。
本标准由中华人民共和国湖北进出口商品检验局负责起草。
本标准主要起草人邵俊杰。
主要参考文献：
FSIS
Chem.Lab .Guidebook
5.034,1988。
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中华人民共和国国家进出口商品检验局1993-06-04批准
1993-08-01实施
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