|
|
| 出口食品中弯曲杆菌检验方法 |
|
| 时间：2004-02-04 10:07:25.25 肉业行业网 |
|
中华人民共和国进出口商品检验行业标准 中华人民共和国进出口商品检验行业标准
出口食品中弯曲杆菌检验方法 SN 0175-92
代替ZB X09 011-88
Method for detection of
campylobacter
species in food for
export
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
1 主题内容与适用范围
本标准规定了出口食品中弯曲杆菌的检验方法。
本标准适用于出口畜肉、禽肉、水产品和牛奶中弯曲杆菌检验。其他出口食品可参
照使用。
2 设备和材料
2.1 微需氧培养设备：最佳微需氧条件为5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气。可用具双
相压力计的厌氧罐、蜡烛缸、气袋或其他可代用的装置。
2.2 天平：称量2000g,感量0.1g。
2.3 均质器。
2.4 离心机：带50mL离心管。
2.5 显微镜：相差或暗视野。
2.6 培养箱：25,37和42℃。
2.7 水浴箱：37℃。
2.8 注射器：20mL。
2.9 针头过滤器：滤膜孔隙为0.65μm。
2.10
三角烧瓶：50,250和500mL。
2.11 平皿：90或100mm。
2.12 吸管：1和5mL。
2.13
试管：16mm×125mm,带螺旋帽。
3 培养基和试剂
3.1 弯曲杆菌增菌肉汤：根据用途,加入1号或2号抗生素溶液制成(A1)。
3.2 弯曲杆菌分离琼脂(改良Skirrow氏培养基)
(A2)。
3.3 含0.18%琼脂的半固体布氏肉汤(A3)。
3.4 布氏琼脂(A4)。
3.5 营养肉汤(A5)。
3.6 中性红溶液(A6)。
3.7 3%过氧化氢溶液。
3.8 氧化酶试验试剂(A7)。
3.9 亚硝酸盐检测(硝酸盐还原)
试剂(A8)。
3.10 乙酸铅纸条：将滤纸条浸入饱和乙酸铅溶液中,然后取出,使其干燥。
3.11 硝酸钾。
3.12
甘氨酸。
3.13 氯化钠。
3.14 盐酸半胱氨酸(cysteine-HCl)。
3.15 马尿酸钠(sodium
hippurate)。
3.16 萘啶酮酸(nalidixic acid): 每个圆纸片含30μg。
3.17
头孢菌新素(又称先锋霉素Ⅰ,cephalothin): 每个圆纸片含30μg。
3.18 茚三酮(ninhydrin)。
3.19
丙酮。
3.20
丁醇。
4 增菌
4.1 碎牛肉
使用加有按1号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤。称取25g样品,置于均质杯内,加
入100mL增菌肉汤,用均质器以8000～10000r/min均质30s。将均质液通过灭菌纱布,倒入
一个容量为250mL的三角烧瓶,置微需氧条件下,42℃培养24～48h。
4.2 净膛全禽和分割禽肉
在一个灭菌容器中,用250mL
灭菌营养肉汤振摇洗涤样品5min。取肉汤,经灭菌纱布
过滤,于23000×g、4℃离心20min,或于16300×g、4℃离心30min,弃去上清液,将沉淀
物混悬放在250mL三角烧瓶中的100mL加有按1号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤中。
培养方法同4.1条。
4.3 牛奶
使用加有按1号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤。称取约40g牛奶放入离心管中,
按4.2条中的方法离心。弃去脂肪和上清液,将沉淀物混悬放在250mL三角烧瓶内的100mL,
增菌肉汤中,培养方法同4.1条。
4.4 贝类
使用加有按2号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤。将100g样品和100mL增菌肉汤放
入均质杯中,用均质器以8000～10000r/min转速均质30s。用灭菌纱布将均质液过滤。取
50mL滤液放在500mL三角烧瓶内的200mL增菌肉汤中,培养方法同4.1条。
4.5 其他食品
所使用的增菌方法决定于食品的种类。虾、整只海鱼和海鱼片经表面洗涤法
(4.2
条)处理后,用加有按2号配方配制的抗生素溶液的增菌肉汤增菌。羊肉和猪肉块可先用
表面洗涤法处理,再用加有按1号配方配制的抗生素的肉汤增菌。碎肉按4.1条所列方法
处理。液体食品按4.3条所列方法处理。各种样品的培养方法均同4.1条。
5 分离和初步鉴定
取5mL经24～48
h增菌的培养物,以0.65μm孔径滤膜过滤。取经过滤和未经过滤的
增菌培养物,分别在分离用琼脂平板上划线接种,各不少于两个平板。将平皿置微需氧条
件下42℃培养24～48h。检查平板上有无透明-白色-棕黄色(可能出现浅红色)凸起、边
缘不整齐、有时沿接种线向外扩散的菌落。挑取典型菌落制作湿片,用相差(或暗视野)
显微镜检查,本菌呈现快速的螺旋样运动。涂片作革兰氏染色镜检时,本菌为革兰氏阴性,
如小逗点状,两菌体的末端相接时,呈S形、海鸥展翅形或螺旋状。挑取初步鉴定为弯典
杆菌菌落,在布氏琼脂上划线作纯分离。培养方法同上。根据生化、生长特性和抗生素
敏感性试验进行菌株证实。
6 证实
6.1 生化试验
从用作纯分离的平板挑选2个典型菌落。从每个典型菌落各挑取一满接种环,分别接
种于放在50mL三角烧杯中的4mL布氏肉汤中,置微需氧条件下42℃培养24～28
h。同时接
种一份已知阳性培养物,以在整个证实试验中作为对照。在大多数情况下,用于生长试验
和生化反应的基础培养基是含0.18%琼脂的布氏肉汤。这种培养基分装在16mm×125mm
试管中,每管7mL。从所有布氏肉汤中取出各接种物,滴加0.2～0.3mL于琼脂表面。
6.1.1 生长温度试验
接种3管含0.002%中性红(NR)的基础培养基,其中一管置37℃培养,检查在这一温度
下的生长情况,并用于观察过氧化氢酶反应。另两管分别置42℃和25℃培养。每日检查
有无生长。对未生长者需培养5d,方可作出最后判断。弯曲杆菌的生长应只限于接近培
养基表面的一薄层,广泛的生长不是由于弯曲杆菌属细菌所致。
6.1.2 过氧化氢酶试验
滴加3%过氧化氢溶液于显示有细菌生长的试管内,出现气泡者为阳性反应。
6.1.3 氧化酶试验
使用琼脂平板表面经24h培养的生长物(也可取用于抗生素试验的平板),将氧化酶试
剂滴于棉拭子上,并用棉拭子去接触表面生长物。在接触点出现深蓝色斑点者为阳性。
6.1.4 硝酸盐还原试验
将供试培养物接种于含1%硝酸钾的基础培养基。置空气中于37℃培养5d。加入亚硝
酸盐检测试剂甲液和乙液(A8),出现红色者表明硝酸盐还原成亚硝酸盐,为阳性反应。
6.1.5 1%甘氨酸中生长试验
将供试培养物接种于加有NR和1%甘氨酸的基础培养基。置空气中于37℃培养。每日
检查有无生长,对未生长者需培养5
d,方可作出最后判断。
6.1.6 3.5%氯化钠中生长试验
将供试培养物接种于加有NR和3.5%氯化钠的基础培养基。置空气中于37℃培养。每
日检查有无生长,对未生长者需培养5
d,方可作出最后判断。
6.1.7 硫化氢产生试验
将肉汤培养物接种于加有0.02%盐酸半胱氨酸的基础培养基,将一根浸有饱和乙酸铅
的滤纸条悬于试管的上部(不让滤纸条接触培养基),旋紧试管帽。置空气中于37℃培养。
每日检查,观察滤纸条是否变黑,纸条变黑表明有硫化氢产生,为阳性反应。对未出现阳
性反应者需培养5
d,方可作出最后判断。
6.1.8 马尿酸盐水解试验
马尿酸盐水解培养基即1%灭菌马尿酸钠溶液,可用试管分装,每管0.4mL,冻存备用。
用2mm接种环取一满环在琼脂平板上培养过夜的生长物,接种1%马尿酸钠溶液中,振摇试
管以分散培养物,置37℃水浴中放置2h。在每个试管中加入0.5mL茚三酮试剂
[将3.5g茚
三酮溶于100mL 1:1丙酮和丁醇的混合物中],将试管于室温下放置2
h。出现紫色者为阳
性反应。
6.2 抗生素敏感性试验
用灭菌棉拭子将预先准备的布氏肉汤培养物涂布于布氏琼脂平板。将含头孢菌新素
(30μg)和萘啶酮酸(30μg)的圆纸片分别贴于平板表面。置微需氧条件下于37℃培养24h,
检查有无抑菌圈。
6.3 根据下表对细菌作出鉴定
弯曲杆菌的特性鉴别
━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
┃
弯 曲 杆 菌
试验项目
┣━━━━━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━
┃胎儿弯曲杆菌胎儿亚种┃空肠弯曲杆菌┃结肠弯曲杆菌┃NARTC**1)
━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━
过氧化氢酶
┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋
氧化酶 ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋
硝酸盐还原 ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋
半胱氨酸形成H2S ┃
＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋
1%甘氨酸中生长 ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋
3.5%氯化钠中生长┃ － ┃ － ┃ － ┃
－
37℃生长 ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋
25℃生长 ┃ ＋ ┃ － ┃ － ┃ －
42℃生长 ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃
＋
马尿酸盐水解 ┃ － ┃ ＋ ┃ － ┃ －
萘啶酮酸试验 ┃ R**2) ┃ S**2) ┃ S ┃ R
头孢菌新素试验
┃ S ┃ R ┃ R ┃ R
━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━
注：1)
NARTC为抗萘啶酮酸嗜温弯曲杆菌。
2) R为耐受; S为敏感。
附 录 A
培养基和试剂
(补充件)
A1 弯曲杆菌增菌肉汤
基础液(布氏肉汤)
胰蛋白胨:
10.0g
蛋白胨: 10.0g
葡萄糖: 1.0g
酵母浸膏: 2.0g
氯化钠:
5.0g
亚硫酸氢钠(NaHSO3) : 0.1g
蒸馏水:
1000mL
将各成分溶于蒸馏水中。121℃高压灭菌15min。最终pH7.0±0.2,分装于规格适宜的
烧瓶。
FBP浓原液
硫酸亚铁(FeSO4):
2.5g
焦亚硫酸钠(Na2S2O5): 2.5g
丙酮酸钠(sodium pyruvate):
2.5g
将各成分溶于100mL蒸馏水中,经0.20μm滤膜过滤除菌,存于4℃。每100mL经灭菌的
基础液中加1mL,混匀。
1号抗生素溶液
万古霉素：0.75
g
三甲氧苄氨嘧啶乳酸盐(trimethoprimlactate): 0.38g
多粘菌素B: 250 000
IU
将各成分溶于500mL蒸馏水中,经0.20μm滤膜过滤除菌。每100mL经灭菌的基础液中
加1mL。
2号抗生素溶液
利福平(rifampicin)
: 0.2g
三甲氧苄氨嘧啶乳酸盐：0.2g
多粘菌素B: 200 000 IU
放线菌酮(actidione) :
2.0g
将各成分置200mL容量瓶中,加入95%乙醇50mL,振摇使溶解,加入蒸馏水至200mL。
过滤除菌,每100mL经高压灭菌的基础液中加1mL。
A2 弯曲杆菌分离琼脂(改良Skirrow氏培养基)
基础液
蛋白胨：15.0g
胰蛋白胨：2.5g
酵母浸膏：5.0g
氯化钠：5.0g
琼脂：15.0g
蒸馏水：1000mL
加热并搅拌使琼脂溶化,121℃高压灭菌15min。冷至50～55℃,最终pH7.4±0.2。
FBP浓原液：
同A1中FBP浓原液,每100mL经灭菌的基础液中加1mL。
抗生素溶液
万古霉素:
0.5g
三甲氧苄氨嘧啶乳酸盐：0.25g
多粘菌素B：125000
IU
蒸馏水：500mL
将各成分溶于500mL蒸馏水中,经0.20μm滤膜过滤除菌,每100mL经高压灭菌的基础
液中加1mL。
冻溶脱纤维羊(或马)血
将羊(或马)血反复冻融3次,使血球完全溶解,每100mL基础液中加入5mL。混匀后倒
入平皿,每皿20mL。
A3 含0.18%琼脂的半固体布氏肉汤
将1.8g琼脂加于1000mL布氏肉汤(A1中基础液),加热并搅拌使琼脂溶化,分装16mm×
125mm试管,每管7mL。121℃高压灭菌15min。最终pH7.0±0.2。
A4 布氏琼脂
将15g琼脂加于1000mL布氏肉汤(A1中基础液),加热并搅动使琼脂溶化,煮沸1min。
121℃高压灭菌15min,最终pH7.0±0.2。
A5 营养肉汤
牛肉膏：3.0g
蛋白胨：5.0g
蒸馏水：1000mL
将各成分加于蒸馏水中,并加热溶解。分装试管时,每管10mL,分装500mL三角烧瓶
时,每瓶225mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.8±0.2。
A6 中性红溶液
将中性红2.0g溶于1000mL蒸馏水中,在培养基灭菌前加入,每100mL培养基中加入1mL。
A7 氧化酶试剂
N,N,N',N'-四甲基对苯二胺盐酸盐(N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine·
2HCl):
1.0g
蒸馏水：100mL
这是一种应首先选用的试剂。将新鲜配制的试液直接滴于琼脂平板或斜面的培养物
上。氧化酶阳性菌落显粉红色,并逐渐变紫。宜用幼嫩培养物进行试验,临用时配制试剂,
但如果试剂是避光冷藏,可用7d。也可将培养物置于浸透有试剂的滤纸条上。必须用铂
丝挑取培养物,用含铁的金属丝会出现假阳性反应。也可用1%N,N-二甲基对苯二胺盐酸
盐(N,N-dimethyl-p-phenylenediamine
hydrochloride)溶液直接加于平板或斜面培养
物上。要保存培养物时,须在3min内将试剂完全倒出,因试剂对细菌有毒性。
A8
亚硝酸盐检测(硝酸盐还原)试剂
甲液: 将0.02gN-(1萘)乙二胺盐酸盐[N-( I naphthyl)
ethylenediamine·2HCl]
加于100mL 1.5mol/L盐酸中,在通风柜中微加热溶解。
乙液: 将1.0
g对氨基苯磺酸加于100mL 1.5mol/L盐酸中,在通风柜中微加热溶解。
━━━━━━━━━━━
附加说明：
本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。
本标准由全国商检系统微生物学标准技术小组起草。
本标准主要起草人邓明义、岳新民、胡楚民。
本标准主要参考美国食品和药物管理局(FDA)《细菌学分析手册》第6版,第10章
(1984年)。
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
中华人民共和国国家进出口商品检验局1992-12-28批准
1993-05-01实施
|
|
|
|
