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SN 0331-94 出口畜产品中炭疽杆菌检验方法

时间:2005-12-13 12:00:00.0 肉业行业网
    中华人民共和国进出口商品检验行业标准 中华人民共和国进出口商品检验行业标准
    SN 0331—94
    出口畜产品中炭疽杆菌检验方法
    Methods for the inspection of bacillus anthrax
    in animal by-products for export 代替 ZB X09 010—86
    ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
    1 主题内容与适用范围
    本标准规定了出口畜产品中炭疽杆菌的检验。
    本标准适用于出口鬃、毛、绒、野生动物毛皮、生骨粒及其他畜产品中炭疽杆菌的检验。
    2 设备和材料
    2.1 离心机:带容量在 500mL以上的离心管。
    2.2 恒温培养箱:36±1℃。
    2.3 恒温水浴:30~65℃。
    2.4 生物学显微镜。
    2.5 三角烧瓶:容量 250mL、500mL和 1 000mL,带胶塞。
    2.6 平皿:直径 90mm或 100mm。
    2.7 试管:10mm×120mm 和 20mm×140mm 。
    2.8 吸管:1 ml和10 ml,带 0.01 mL 和0.1 mL刻度。
    2.9 L形玻璃棒。
    2.10 注射器:1 mL 带 5号针头。
    2.11 棉拭子:长180 mm 的竹签或铁丝,一端裹 20~30 mm长的棉球,用水浸湿,另一端裹在试管的棉塞内,插入试管高压灭菌。
    2.12 棉布袋:70 mm×130 mm,带缩口绳。
    2.13 养鼠罐。 
    3 培养基和试剂
    3.1 溶菌酶多粘菌素琼脂:见A1。
    3.2 戊烷脒多粘菌素琼脂:见A2。
    3.3 营养肉汤:见A3。
    3.4 营养琼酯:见A4。
    3.5 洗样液:见A5。
    3.6 生理盐水:见A6。
    3.7 缓冲生理盐水:见A7。
    3.8 固定液:见A8。
    3.9 炭疽杆菌噬菌体:见A9。
    3.10 革兰氏染色液:见A10。
    3.11 大豆凝集素稀释液:见A11。
    4 抽样 
    4.1 鬃、毛、绒、生骨粒
    4.1.1 抽样数量
    按生产日期或原料来源划分批次。每批按 30%开包(箱)抽样或在扎包(装箱)时由每包(箱)各取一份样品。
    4.1.2 抽样方法
    用火焰灭菌的镊子或戴经消毒的乳胶手套从每包(箱)的不同部位共抽样 3~5g,装入灭菌棉布袋内,将袋口扎紧,作上批次标记。
    4.1.3 送样
    将样品装入塑料袋或铁桶内,密封后送样。 
    4.2 动物毛皮
    4.2.1 抽样比例
    逐张取样。
    4.2.2 抽样方法
    用灭菌棉拭子涂擦样皮的真皮面。将棉拭子插入试管,塞紧棉塞。
    4.2.3 送样
    将试管逐支用纸包裹,装入铁桶内,再用棉花或软纸填充空隙,密封后送样。
    5 样品处理
    5.1 鬃、毛、绒、生骨粒
    5.1.1 根据样品多少将适当数量的同批样品(最多不超过 10份)合编为一个检验样品单位,作好记录。
    5.1.2 从合编为一个检验样品单位的每个样品袋中各取 1~2g样品,一起放入一个适当大小的灭菌三角烧瓶中。
    5.1.3 加样品量 30~40倍(W/V)的预冷洗样液于三角烧瓶,用灭菌胶塞将瓶口塞严。
    5.1.4 将三角烧瓶放入冰水浴或 0~4℃冰箱内,间或摇动约 1h。
    5.1.5 将瓶中洗样液倒入 500mL灭菌离心管内,盖住管口,以3000r/min离心20min。
    5.1.6 弃去上清液(注意防止污染),加少许灭菌水,使沉淀均匀悬浮。
    5.1.7 将离心管静置 5~10min,待杂质下沉后,将上悬液移入另一支灭菌试管内,于65℃恒温水浴加热 30 min。
    5.1.8 加洗样液后的样品于热处理前如不能及时检验,应贮于0~4℃冰箱内,以防芽胞发芽。
    5.2 动物毛皮
    如不立即检验,将棉拭子放于0~4℃冰箱内。
    6 检验方法
    6.1 分离培养
    6.1.1 鬃、毛、绒、生骨粒
    6.1.1.1 根据每管所包括样品份数之多少,各接种 1~3个溶菌酶多粘菌素平板或戊烷脒多粘菌素平板。接种时,用灭菌吸管吸取样液,滴加于平板表面,各0.1~0.3mL。如有剩余样品,可增接数个平板,直至将样品接种完。
    6.1.1.2 用灭菌 L形玻璃棒将滴加的样液涂布均匀。如样液较多,可将平板置于36±1℃温箱,微开皿盖,使样液迅速干燥。
    6.1.1.3 翻转平皿,置于36±1℃恒温箱,培养 24~48h。
    6.1.2 动物毛皮
    6.1.2.1 将棉拭子由试管内取出,各涂抹一个溶菌酶多粘菌素平板或戊烷脒多粘菌平板。
    6.1.2.2 翻转平皿,置于36± 1℃恒温箱,培养 24~48 h。
    6.2 菌落及菌形观察
    6.2.1 将培养的平板取出,用肉眼,必要时借助放大镜观察有无典型炭疽杆菌菌落。炭疽杆菌菌落扁平、暗灰色、不透明、无光泽、表面粗糙、边缘不整齐。用放大镜观察,边缘呈卷发状,用接种针探触,有粘滞感,挑之,可拉起丝。
    6.2.2 从典型或可疑菌落取培养物制备涂膜,经革兰氏染色,镜检。炭疽杆菌被染成蓝紫色,由多个菌纵连成长链。少数单个菌呈大杆状,两端平齐。有的菌体中央可见卵圆形不着色的芽胞。芽胞不使菌体膨大。
    6.3 肉汤培养特性观察
    取菌落和菌形均似炭疽杆菌的培养物,接种肉汤管,于 36±1℃恒温箱培养 5~12h,观察细菌生长情况。炭疽杆菌在肉汤中生长初期的特征是:肉汤上部澄清,无菌膜,下部有絮状沉淀,沉淀不易摇散。
    6.4 确定试验
    6.4.1 大豆凝集素吸收试验
    6.4.1.1 方法
    a. 加大豆凝集素稀释液(A11)一滴于比色板或载玻片上。
    b. 用接种环取一满环可疑菌落,研混于大豆凝集素稀释液内成浓厚菌液,持续搅拌
    2~3min。
    c. 加一滴 5%兔血球悬液,搅匀,前后倾动玻片 3~5min,观察血球是否凝集。
    6.4.1.2 判定
    ++++:血球凝集成块状,均匀散布,液体无色。
    +++:血球凝集成大颗粒,均匀散布,液体无色。
    ++:血球凝集成颗粒,均匀散布,液体无色。
    +:血球凝集成细小颗粒,均匀散布,液体无色。
    ±:血球凝集成细微颗粒,均匀散布,液体呈不显著黄红色。
    -:血球不凝集,摇动后汇集于中央,呈淡黄红色,液体呈不显著黄红色。
    注:“+++”~“+”为阳性。“±”为可疑。“-”为阴性。
    6.4.2 噬菌体裂解试验
    6.4.2.1 方法
    a. 用营养琼脂平板的皿底外面画三个直径约 30mm ,相隔约 20mm为圆圈。
    b. 用接种环取可疑炭疽杆菌的新鲜肉汤培养物涂满与两个圆圈相对应的琼脂表面。另取已知炭疽杆菌的新鲜肉汤培养物,涂满与第三个圆圈相对应的琼脂表面,作上区分的标记。
    c. 待菌液被吸干后,在接种被检菌的圆圈内,一个加一滴无菌肉汤,另一个加一滴炭疽杆菌噬菌体。在接种已知炭疽杆菌的圆圈内,加一滴炭疽杆菌噬菌体。
    d. 将平皿放入36±1℃ 恒温箱(隔架面要平,以防噬菌体液流散),微开皿盖,使液体迅速干燥。然后翻转平皿,培养12~18h。
    6.4.2.2 判定
    a. 加噬菌体的两个圆圈内都出现蚀斑,加肉汤的圆圈内无蚀斑,为阳性反应。
    b. 加已知炭疽杆菌的圆圈内出现蚀斑,加被检菌的两个圆圈内无蚀斑,为阴性反应。
    c. 三个圆圈内都无蚀斑,表明噬菌体已失效,应另换有效噬菌体进行试验。
    6.4.3 串珠试验
    6.4.3.1 方法
    a. 取适量 4~12h可疑炭疽杆菌肉汤培养物,接种于 1.8mL肉汤管内(制备湿片在低倍显微镜下检查,每个视野应含菌链 5~10条)。
    b. 加 5IU/mL青霉素 0.2mL,使青霉素最终浓度为 0.5IU/mL 。
    C. 于 37℃水浴培养 1~2h ,取出,加入 20% 福尔马林 0.25 mL,固定 10 min。
    d. 制备湿片,在显微镜下检查。
    6.4.3. 判定
    ++++:菌体大而圆,均匀,排列整齐;
    +++:菌体圆,均匀,排列整齐;
    ++:菌体椭圆,排列整齐;
    +:菌体均匀肿大,变粗;
    ±:菌体大小不一,不圆,排列不整齐;
    -:菌体形态无变化。
    注:“++++”~“+”为阳性。“±”为可疑。“-”为阴性。
    6.4.4 动物试验
    6.4.4.1 取可疑炭疽杆菌的肉汤培养物,用生理盐水稀释为 10 000个菌/mL(微混浊),接种 2~3只小白鼠。一只于皮下注射 0.1mL;其余每只于腹腔注射 0.2mL。
    6.4.4.2 如小白鼠死亡(通常于1~3d内),立即进行剖检,观察有无炭疽病理变化(如皮下胶样水肿,脾脏肿大,血凝不良),制备数张血液和腹水涂片,供做菌形检查,同时取病变材料或体液接种数管肉汤,以备核查。
    6.4.5 染色镜检
    6.4.5.1 染色液的配制
    A液:
    美蓝 0.3g
    乙醇(95%) 30.0mL
    B液:
    0.01%氢氧化钾溶液 100mL
    将 A、B两液混合而成。
    6.4.5.2 染色方法
    a. 将被检材料的涂片浸入固定液内 15~20 min;
    b. 滴加染色液浸没涂膜,染色 1~2 min;
    c. 用水冲去染色液,自然干燥或用吸墨纸吸干水分;
    d. 镜检。
    6.4.5.3 判定
    炭疽菌菌体呈蓝色,粗大杆状,两端平齐,相连成短链或成对,菌体周围以淡蓝紫色荚膜。
    7 结果的判定和报告
    7.1 结果的判定
    在菌落形态、细菌形态和肉汤生长特性三项中有一项不符合炭疽杆菌特征时,判为非炭疽杆菌。在其余五项试验(确定试验)中有两项或更多项不符合炭疽杆菌特征时,判为非炭疽杆菌;全部符合或仅有一项不符合炭疽杆菌特征时,判为有炭疽杆菌。
    7.2 结果的报告
    7.2.1 凡结果判为非炭疽杆菌的检验样品,报告该样品所代表的同批产品“经检验未发现炭疽杆菌”。
    7.2.2 凡结果判为有炭疽杆菌的检验样品,报告该样品所代表的同批产品“经检验发现炭疽杆菌”。
    附 录 A
    培养基和试剂
    (补充件)
    A1 溶菌酶多粘菌素琼脂(Knisely)
    营养琼脂(见A4) 1 000mL
    多粘菌素 3 000IU
    溶菌酶 4 mg/mL 溶液 10 mL
    乙酸亚铊 4 mg/mL 溶液 10 mL
    EDTA 20 mg/mL 溶液 10 mL
    除营养琼脂外,将其他成分用灭菌蒸馏水配成适当贮备液,按以上量加于冷至 50~55℃ 的灭菌营养琼脂内,充分摇匀,倾注平板。
    A2 戊烷脒多粘菌素琼脂
    A2.1 基础培养基
    牛肉膏 3.0g
    蛋白胨 20.0g 
    氯化钠 5.0g
    琼脂 20.0g
    蒸馏水 1 000.0mL
    将各成分加于蒸馏水中,煮沸至完全溶解,调整pH至7.4,过滤,分装于三角烧瓶中,每瓶 400mL,121℃高压灭菌 20min。临时用加热融化,放于 45~50℃恒温水
    浴内保温。
    A2.2 戊烷脒稀释液
    称取戊烷脒 0.1g,溶于 4mL灭菌蒸馏水内。贮存在 0~4℃ 冰箱,备用。
    A2.3 多粘菌素稀释液
    取多粘菌素 B一瓶,加灭菌蒸馏水使其溶解,再用灭菌蒸馏水将其稀释为3000IU/mL。
    贮存于0~4℃冰箱,备用。
    A2.4 脱纤维羊血
    以无菌操作采羊血 50~10 mL ,注入含玻璃小珠的灭菌三角烧瓶中,立即转摇数分钟。贮存于 0~4℃冰箱,备用。
    A2.5 完全培养基
    基础培养基(45~50℃) 400.0 mL
    戊烷脒稀释液 0.4 mL
    多粘菌素稀释液 0.4 mL
    脱纤维羊血 8.0 mL
    以无菌操作将后三种成分加入基础培养基内,充分摇匀,倾注于灭菌皿内,每皿15mL
    左右。
    A3 营养肉汤.
    牛肉膏 3.0g
    蛋白胨 20.0g
    氯化钠 5.0g
    蒸馏水 1000.0mL
    将各成分溶于蒸溜水中,调整pH至7.4,分装于试管内,每管1.0mL,121℃高压灭菌15min。 
    A4 营养琼脂
    牛肉膏 3.0g
    蛋白胨 20.0g
    氯化钠 5.0g
    琼脂 20.0g
    蒸馏水 1 000.0mL
    将各成分加于蒸馏水中,煮沸至完全溶解,补足失去的水分,调整pH至7.2,过滤,121℃ 高压灭菌 20 min 。待冷至 50℃左右时,倾注于平皿,制成平板。
    A5 洗样液
    吐温-20 2.5mL
    蒸馏水 1 000mL
    将吐温-20加于蒸馏水中,充分搅匀,分装于三角烧瓶或试剂瓶内,121℃高压灭菌。贮存于 0~4℃冰箱,备用。
    A6 生理盐水
    氯化钠 8.5g
    蒸馏水 1000.00mL
    待氯化钠完全溶解后,分装于三角烧瓶或试剂瓶内,121℃高压灭菌 20min。
    A7 缓冲生理盐水
    无水磷酸氢二钠 1.42 g
    氯化钠 8.50 g
    蒸馏水 1 000.00 mL
    将各成分加于蒸馏水中,加热搅拌使完全溶解。如欲长期保存,可加 0.1g硫柳汞(最终浓度为 0.01%)。
    A8 固定液
    无水乙醇 600 mL
    三氯甲烷 300 mL
    甲醛溶液(36%~38%) 100 mL
    将三种成分混匀,贮存于磨砂口带盖试剂瓶内。
    A9 炭疽杆菌噬菌体
    γ或 ω型的均可使用。
    A10 革兰氏染色液及染色方法
    A10.1 Hucker 氏结晶紫液
    A液:
    结晶紫(或龙胆紫) 2.0g
    ⿳ 乙醇(95%) 20.0mL
    B液:
    草酸铵 0.8g
    蒸馏水 80.0 mL
    将 A、B两液混匀,放置 24 h后,用粗滤纸过滤。贮于磨砂口滴瓶内。 
    A10.2 革兰氏碘液
    碘 1.0 g
    碘化钾 2.0 g
    蒸馏水 300.0 mL 
    将碘和碘化钾放于乳钵内,研成细粉。先后分三次分别加蒸馏水1mL 、5mL和10 mL,继续研磨至完全溶解,倒入褐色瓶中。再加水将残留于乳钵的碘液洗入瓶中,补加蒸馏水至300mL。
    A10.3 脱色剂
    95%乙醇 适量
    贮于磨砂口滴瓶中。
    A10.4 Hucker氏复染液(贮备液)
    沙黄 O 2.5 g
    乙醇(95%) 100mL
    临用时,取适量贮备液,加蒸馏水稀释成 1:10稀释液。
    A10.5 染色方法
    a. 于载玻片上制备涂膜,自然干燥;
    b. 将玻片浸入固定液内,固定 1 min;
    c. 加结晶紫于涂膜上,染色 1 min;
    d. 用水冲去染色液,淋去多余的水; 
    e. 加革兰氏碘液于涂膜上,媒染 1 min;
    f. 用水冲去碘液;
    g. 连续加 95%乙醇流过涂膜,至无紫色脱掉;
    h. 用水冲洗玻片,淋去多余的水;
    i. 加复染液于涂膜上,染色 10~30 s;
    j. 用水冲去染色液;
    k. 用吸墨纸吸干水分或自然干燥;
    l. 镜检。
    A11 大豆凝集素稀释液
    按试剂使用说明制备工作稀释液,贮于 4℃冰箱备用。
    ━━━━━━━━━
    附加说明:
    本标准由中华人民共和国进出口商品检验局提出。
    本标准由中华人民共和国内蒙古进出口商品检验局负责起草。
    本标准主要起草人甄宏太、周云霞。
    ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
    中华人民共和国国家进出口商品检验局 1994-12-26批准 1995-05-01实施

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