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SN 0296-93 出口禽肉中莫能菌素残留量检验方法

时间:2005-12-13 12:00:00.0 肉业行业网
    中华人民共和国进出口商品检验行业标准 中华人民共和国进出口商品检验行业标准
    出口禽肉中莫能菌素残留量检验方法
    生物自显影法 SN 0296一93
    Method for the determination of monensin
    residues in poultry meat for export
    —Bioautography method
    ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
    1 主题内容与适用范围
    本标准规定了出口禽肉中莫能菌素残留量的抽样、制样和生物自显影测定法。
    本标准适用于出口冻鸡中莫能菌素残留量的检验。
    2 抽样和制样
    2.1 检验批
    以不超过2500件商品为一检验批。
    同一检验批的商品应具有相同特征,如包装、标记、产地、规格和等级等。
    2.2 抽样数量
    批量,件            最低抽样数,件
    1~25                 1
    26~100                5
    101~250 10
    251~500 15
    501~1000               17
    1001~2500               20
    2.3 抽样方法
    按2.2规定的抽样件数随机抽取,逐件开启。每件至少取一袋作为原始样品,原始样品总量不少于2kg,放入清洁容器内,加封后标明标记,及时送交实验室。
    2.4 样品制备
    从每袋原始样品中取出部分有代表性样品,将可食部分放入高速组织捣碎机中捣碎均匀,充分混匀,用四分法缩分出不少于1kg试样。装入清洁容器内,加封后标明标记。
    2.5 样品保存
    将试样于—18℃冷冻保存。
    注:在抽样及制样过程中,必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
    3 测定方法
    3.1 方法提要
    用甲醇提取肉样中莫能菌素,经四氯化碳萃取后浓缩至干,以甲醇溶解残留物,用薄层分离,再用生物自显影法测定。
    3.2 设备和材料
    3.2.1 微量注射器:50 μL。
    3.2.2 薄层板:硅胶,Q/YT 257—85SG,5cm×20cm,使用前110℃活化2h。
    3.2.3 展开缸:240mm×57mm×32mm。
    3.2.4 游标卡尺:测量范围0~200mm,精度0.02mm或使用抑菌圈测量仪测量。
    3.2.5 离心机:转速3000 r/min。
    3.2.6 旋转浓缩器。
    3.2.7 恒温培养箱:37±1℃。
    3.2.8 高压灭菌器。
    3.2.9 长方形培养皿:20cm×10cm×5cm。
    3.2.10 均质器:带均质杯250mL。
    3.3 试剂和培养基
    3.3.1 试剂
    3.3.1.1 甲醇:分析纯。
    3.3.1.2 四氯化碳:分析纯。
    3.3.1.3 乙酸乙酯: 分析纯。
    3.3.1.4 莫能菌素标准品: 960μg(效价)/mg(中国兽药监察所提供)。
    3.3.1.5 试验菌种:枯草杆菌(Bacillus subtilis), 菌种号ATCC 6633(卫生部药品生物制品检定所提供)。
    3.3.2 培养基
    3.3.2.1 菌种用培养基(见附录A 第A1章)。
    3.3.2.2 生物自显影用培养基(见附录A第A2章)。
    3.3.2.3 肉汤培养基(见附录A第A3章)。
    3.4 测定步骤
    3.4.1 工作液制备
    3.4.1.1 莫能菌素标准贮备液
    准确称取适量的莫能菌素标准品,用甲醇溶解配制成浓度为500μg(效价)/mL的莫能菌素标准溶液。配制后于冰箱中保存,一周内使用。
    3.4.1.2 莫能菌素标准工作液
    吸取标准贮备液,用甲醇分别稀释成2,3,4,5,10和15μg(效价)/mL的标准工作标准液。以上稀释液均须当日配制。
    3.4.1.3 菌种培养及芽胞菌悬浮液制备
    将菌种安瓿瓶的上部消毒后敲碎,加入少量肉汤培养基,使其溶解并移至肉汤管中混匀。置37±1℃温箱中培养24h。将培养物接种于菌种培养基中,置于37±1℃培养一周,镜检含芽胞菌数达85%以上, 便可制备芽胞悬浮液。
    用适量灭菌生理盐水冲洗菌苔,然后将该菌液转移至离心管中,充分摇匀后,于3000r /min离心30min, 弃去上清液,再加入同样量的灭菌生理盐水重复离心一次。弃去上清液,再加入适量灭菌生理盐水,摇匀后于65℃水浴中加热30min,然后,于1000 r/min离心5min, 取上清液并转入灭菌试管中,即为芽胞菌悬浮液,置于冰箱中保存,可使用一个月。
    3.4.2 试液制备:准确称取绞碎试样10g(精确至0.1g)于均质杯中,加入20mL甲醇,均质2min后,移入离心管中,于3000 r/min离心20min。取其上清液15mL,转入盛有5mL蒸馏水的250mL分液漏斗中,混合后加入10 mL四氯化碳,充分振摇,静置分层,放出四氯化碳层于150 mL茄形瓶中。用四氯化碳再重复提取两次, 合并四氯化碳至上述茄形瓶中, 于50~60℃水浴中用旋转蒸发器浓缩至干,加入0.5mL甲醇溶解残留物供TLC实验用。此样液中相当于禽肉试样浓度为15g/mL。
    3.4.3 测定
    3.4.3.1 生物自显影
    将每个样品及标准溶液分别点在四块薄层板上,先于每块薄层板下端2cm处划一条基线,然后在这条基线上分别点20μL试液和3μg(效价)/mL莫能菌素标准溶液,试液和标准溶液点相距2.5cm。在展开缸中用乙酸乙酯进行展开,直至溶剂前沿线距板顶端1.5cm处为止,取出薄层板,风干后备培养用。将薄层板水平置于高压灭菌的长方形培养皿中,无菌操作将已熔化并冷却至50~55℃的生物自显影用培养基均匀地喷在其表面上,然后用10mL上述接种芽胞菌悬液的培养基铺满整个薄层板,保持水平,待其凝固,于37±1℃培养18 h。
    3.4.3.2 对照试验
    除不加试样外,按上述测定步骤进行。
    3.5 结果计算和表述
    经过培养后,在薄层板上与莫能菌素标准液产生抑菌圈的Rf值(约0.38)相同位置上,显现抑菌圈者即为阳性。
    当样品判定为阳性时,测量四块薄层板上的试液及标准溶液产生的抑菌圈直径,分别计算出平均值。当每组四个直径值的相对标准偏差(RSD)均不超过5%时,并且试液的抑菌圈直径与标准溶液(20μL)的抑菌圈直径近似(直径相差不超过±1mm),则其样品中莫能菌素含量按下式计算:
    c
    X=──
    m
    式中:X——样品中莫能菌素的含量,mg/kg;
    c——试验中所用的标准溶液的浓度,μg/mL;
    m——最终试液所代表的禽肉试样的浓度,g/mL。
    4 测定低限、回收率
    4.1 测定低限
    本方法测定低限为0.20mg(效价)/kg。
    4.2 回收率
    回收率的实验数据:莫能菌素浓度在0.20~0.67mg(效价)/kg范围内,回收率为81%~
    100%。
    附 录 A 
    培养基成分及制备方法
    (补充件)
    A1 菌种用培养基
    蛋白胨 10.0g
    牛肉浸膏 5.0g
    氯化钠          2.5g
    琼脂 15.0g
    蒸馏水 1000mL
    将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液或10%盐酸调节pH,使其灭菌后pH为6.5±0.1,分装于试管或克氏瓶内,于121℃ 15min高压灭菌,灭菌后制备成所需斜面备用。
    A2 生物自显影用培养基
    蛋白胨 10.0g
    酵母浸膏         2.5g
    葡萄糖 10.0g
    琼脂 15.0g
    蒸馏水 1000mL
    将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液或10%盐酸调节pH,使其灭菌后pH为6.0±0.1,分装于锥形瓶内,于121℃15 min高压灭菌,备用。
    A3 肉汤培养基
    蛋白胨 10.0g
    牛肉浸膏         5.0g
    氯化钠          2.5g
    蒸馏水 1000mL
    将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液或10%盐酸调节pH,使其灭菌后pH为7.0±0.1,分装于试管中,于121℃15min高压灭菌。
    附 录 B 
    检验程序图
    (补充件)
    试样(10.0g) 试验菌培养
    ┃ ┃
    ┃ 于均质杯内加入 ┃
    ┃ 20 mL甲醇 ┃
    ┃ ┃
    均质2 min ┃
    ┃ 移入离心管 ┃
    ┃ ┃
    离心20 min(3000r/min) 菌液制备
    ┃ ┃
    取上清液(15 mL) ┃
    ┃ 转入盛有5mL蒸馏 生物自显影用培养基
    ┃ 水的分液漏斗中 ┃
    ┃ ┃
    ┃ ┃
    加入四氯化碳(10 mL) ┃
    ┃ 充分振摇后分取四氯化碳层 ┃
    ┃ 转入茄形瓶中, 再重复两次 ┃
    ┃ ┃
    合并入上述茄形瓶中 ┃
    ┃ ┃
    蒸干 ┃
    ┃ ┃
    用0.5mL甲醇溶解 ┃
    ┃ ┃ 
    层析 ┃ 
    ┃ ┃ 
    ┗━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━┛ 
    ┃
    培养 
    ┃
    ┃
    检定
    ┃
    ┃
    结果和表述 
    ━━━━━━━━━━━
    附加说明:
    本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。
    本标准由中华人民共和国天津进出口商品检验局负责起草。
    本标准主要起草人袁而森、王素琴、李剑影。
    本标准等同采用日本厚生省检验方法:畜水产食品中の残留物质检查法(1990)。
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    中华人民共和国国家进出口商品检验局1993-12-28批准 1994-05-01实施

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