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SN 0295-93 出口禽肉中杆菌肽残留量检验方法

时间:2005-12-13 12:00:00.0 肉业行业网
    中华人民共和国进出口商品检验行业标准 中华人民共和国进出口商品检验行业标准
    出口禽肉中杆菌肽残留量检验方法
    杯 碟 法 SN 0295—93
    Method for the determination of bacitracin
    residues in poultry meat for export
    —Cylinder-plate method
    ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
    1 主题内容与适用范围
    本标准规定了出口禽肉中杆菌肽残留量的抽样、制样和杯碟测定法。
    本标准适用于出口冻鸡中杆菌肽残留量的检验。
    2 引用标准
    SN 0179 出口食品中四环素族抗生素残留量检验方法
    3 抽样和制样
    3.1 检验批
    以不超过2500件商品为一检验批。
    同一检验批的商品应具有相同特征,如包装、标记、产地、规格和等级等。
    3.2 抽样数量
    批量,件            最低抽样数,件
    1~25               1
    26~100               5
    101~250              10
    251~500              15
    501~1000              17
    1001~2500              20
    3.3 抽样方法
    按3.2规定的抽样件数随机抽取,逐件开启,每件至少取一袋作为原始样品,原始样品总量不少于2kg,放入清洁容器内,加封后,标明标记,及时送交实验室。
    3.4 样品制备
    从每袋原始样品中取出部分有代表性样品,将可食部分放入绞碎机中绞碎均匀,充分混匀、用四分法缩分不少于1kg试样,装入清洁容器内,加封后,标明标记。
    3.5 样品保存
    将试样于—18℃冷冻保存。
    注:在抽样及制样过程中,必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
    4 测定方法
    4.1 方法提要
    用33%吡啶溶液提取试样中杆菌肽,将提取液再用甲醇提取,经减压浓缩至干,用磷酸盐缓冲液溶解残留物,调整pH后用杯碟法测定。
    4.2 设备和材料
    4.2.1 培养皿:内径90mm,底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿,并应配有陶瓦盖。
    4.2.2 牛津杯:外径7.8±0.1mm,内径6.0±0.1mm,高10±0.1mm,不锈钢管。
    4.2.3 游标卡尺:测量范围0~200mm,精度0.02mm,或使用抑菌圈测量仪测量。
    4.2.4 离心机:转速3000r/min。
    4.2.5 旋转式真空浓缩器。
    4.2.6 恒温培养箱:36±1℃。
    4.2.7 高压灭菌器。
    4.2.8 其他:玻璃板,吸管,滴管,茄形瓶等。
    4.3 试剂和培养基
    4.3.1 试剂
    4.3.1.1 吡啶: 分析纯。
    4.3.1.2 吡啶溶液:33%。取吡啶33mL,用蒸馏水定容至100mL。
    4.3.1.3 甲醇:分析纯。
    4.3.1.4 磷酸盐缓冲液:5%, pH6.5。称取22.15g无水磷酸氢二钾和27.85g无水磷酸二氢钾溶解于蒸馏水中,定容至1000mL。
    4.3.1.5 氢氧化钠溶液:1mol/L。
    4.3.1.6 磷酸盐缓冲液:1%, pH6.0。称取2.0g无水磷酸氢二钾和8.0g无水磷酸二氢钾溶解于蒸馏水中,定容至1000 mL。
    4.3.1.7 杆菌肽标准品:58 IU/mg(卫生部药品生物制品检定所提供)。
    4.3.1.8 试验菌种:藤黄微球菌(Micrococcus Luteus), 菌种号28008(卫生部药品生物制品检定所提供)。
    4.3.2 培养基
    4.3.2.1 增菌用培养基: 见附录A第A1章。
    4.3.2.2 基层用培养基: 见附录A第A2章。
    4.3.2.3 菌种层用培养基: 见附录A第A3章。
    4.4 测定步骤
    4.4.1 工作液制备
    4.4.1.1 杆菌肽标准贮备液
    准确称取适量的杆菌肽标准品,用1%pH6.0磷酸盐缓冲液配制成100 IU/mL的标准贮备液,于冰箱中保存,可使用一周。
    4.4.1.2 杆菌肽标准工作液
    吸取一定量杆菌肽标准贮备液,用1%pH6.0磷酸盐缓冲液稀释成0.15和0.6 IU/mL的工作标准液,以及0.025,0.050,0.100,0.200,0.400,0.800 IU/mL的稀释液,作为制备标准曲线的标准浓度溶液,0.100 IU/mL的稀释液为参考浓度溶液。以上稀释液均须当日配制。
    4.4.1.3 菌种培养及菌液的制备
    将试验菌种安瓿瓶上部消毒后敲碎,加入少量增菌用培养基(4.3.2.1)溶解后,移入以上培养基中,混匀后于36±1℃培养24h,再转接至琼脂试管斜面(4.3.2.3), 培养16~18h,然后加入适量生理盐水,将菌苔洗下,备用。
    4.4.2 试液制备:准确称取经绞碎混匀的试样10.0g于均质器内,加入17mL吡啶溶液(33%),均质3min后,移入离心管中离心20 min(3000 r/min)。取上清液10mL,置于另一个离心管内,加入30 mL甲醇充分振摇2min,再离心 20min(3000 r/min)。将上清液移入茄形瓶中,减压浓缩至干,加入3mL磷酸盐缓冲液(5%)溶解即为样液。此样液中相当于禽肉试样浓度为1.96g/mL。
    4.4.3 测定
    4.4.3.1 平板制备
    于无菌平皿中加入 20mL熔化的基层用培养基(4.3.2.2),保持水平,待其凝固备用。然后,将锥形瓶中菌种层用培基(4.3.2.3)经熔化并冷却至50~55℃,加入适量的试验菌液(4.4.1.3)使之充分混合后,取4mL注入上述基层培养基上,保持水平,待其凝固。在测定前应先用0.15 IU/mL标准工作液对该菌液浓度的平板进行预测试,经培养后其标准工作液所呈现的抑菌圈直径在10mm以上,则该菌液浓度的平板即可使用,否则须调整其菌液浓度,制成合于检定用的平板。
    4.4.3.2 标准曲线的制备
    可参照SN 0179—92中的6.1。
    4.4.3.3 检测
    每个样品用三个检定平板,在每个平板上,如不需定量时,置4 只消毒的牛津杯,对角2只注满样液,剩余的2只杯里分别注满0.6IU/mL和0.15 IU/mL杯菌肽标准工作液;如需定量时,须置6只消毒的牛津杯,间隔注满样液和0.1 IU/mL杆菌肽标准工作液,于36±1℃培养17±1 h。
    4.5 结果计算和表述
    4.5.1 结果计算和表述
    在三个检定平板上,如样液呈出与0.6IU/mL和0.15IU/mL标准工作液相同的清晰抑菌圈时,可用游标卡尺或测量仪进行测量,其抑菌圈平均直径在10 mm以上者为阳性。对于需定量的实验结果,将分别算出三个检定平板上0.1 IU/mL和样液的抑菌圈直径的平均值,经校正后,于标准曲线上查出其抑菌圈直径的平均值所对应的标准浓度值,通过式(1)计算可得出样品中抗生素的含量:
    c
    X=── ......................(1)
    m
    式中:X——样品中杆菌肽的含量,IU/g;
    c——从标准曲线上查出样液所对应的抗生素浓度,IU/mL;
    m——最终试液所代表的禽肉试样的浓度,g/mL。
    4.5.2 结果换算
    如果样品中杆菌肽含量的单位要采用mg/kg表示时,可将IU/g按照下述方法进行换算:
    标准品中杆菌肽含量=A IU/mg
    样品中杆菌肽含量=B IU/g
    1 IU=1/A mg=1/A×10**3μg .............................(2)
    B IU/g=B/A×10**3μg/g=B/A×10**3mg/kg .................(3)
    式中:A——标准品中杆菌肽含量的数值;
    B——依据式(1)计算所得到的样品中杆菌肽的数值。
    5 测定低限、回收率
    5.1 测定低限
    本方法测定低限为0.025 IU/g。
    5.2 回收率
    回收率的数据:杆菌肽添加浓度在0.025~0.100IU/g范围内,回收率为74.8%~108.8%。
    ━━━━━━━━━━━
    附 录 A 
    培养基成分及制备方法
    (补充件)
    A1 增菌用培养基
    蛋白胨 10.0g
    牛肉浸膏        5.0g
    氯化钠         2.5g
    蒸馏水 1000mL
    将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1 mol/L氢氧化钠溶液或10%盐酸调节pH,使其灭菌后pH为7.0±0.1, 分装于小试管中,每管约3mL,于121℃15min高压灭菌。
    A2 基层用培养基
    蛋白胨         6.0g
    牛肉浸膏         1.5g
    酵母浸膏        3.0g
    琼脂 15.0g
    蒸馏水 1000mL
    将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液或10%盐酸调节pH,使其灭菌后pH为6.5±0.1,分装于锥形瓶内,于121℃15 min高压灭菌,备用。
    A3 菌种层用培养基
    蛋白胨         6.0g
    牛肉浸膏        1.5g
    酵母浸膏        3.0g
    葡萄糖         1.0g
    胰酪蛋白        4.0g
    琼脂 15.0g
    蒸馏水 1000mL
    将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液或10%盐酸调节pH,使其灭菌后pH为6.5±0.1,分装于锥形瓶和大试管内,于121℃15min高压灭菌。灭菌后将试管
    制备成所需斜面备用。
    附 录 B
    检验程序图
    (补充件)
    试样(10.0g)           标准贮备液           试验菌培养
    ┃               ┃               ┃
    ┃ 于均质杯内加入 ┃ ┃
    ┃ 17 mL33%吡啶 ┃ ┃
    ┃ ┃ ┃
    均质3min ┃ ┃
    ┃ 移入离心管 ┃ ┃
    ┃ ┃ ┃
    离心20min(3000r/min) 标准工作液           菌液制备
    ┃               ┃ ┃
    取上清液(10mL) ┃ ┃
    ┃ ┃ ┃
    ┃ 加入30mL甲醇 ┣━━━━━━━━━━━━检定用平板制备
    ┃ ┃               ┃
    振摇2min ┃ ┃
    ┃ ┃ ┃
    离心20min 制备标准曲线 ┃
    ┃ ┃
    取上清液入茄形瓶 ┃
    ┃ ┃
    蒸 干 ┃
    ┃ 加入3 mL 5% ┃
    ┃ 磷酸盐缓冲液 ┃
    ┃ ┃
    样液(pH6.5) ┃
    ┃ ┃
    ┗━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━┛
    ┃ 
    检 测
    ┃ 
    结果计算和表述
    ━━━━━━━━━━━
    附加说明:
    本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。
    本标准由中华人民共和国天津进出口商品检验局负责起草。
    本标准主要起草人袁而森、王素琴、李剑影。
    本标准等同采用日本厚生省检验方法,畜水产食品中の残留物质检查法(1990)。
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    中华人民共和国国家进出口商品检验局1993-12-28批准 1994-05-01实施

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